對于老生常談的分析方法驗證（analyticalmethod validation），小編以為，是通過過程用數據來說明分析方法的可行性，以證明所用的分析方法適用于相應的檢測要求。

一、哪些項目需要進行方法驗證呢？

1、鑒別實驗；

2、原料（指API）或制劑中有效成分含量的測定；

3、制劑中其他成分，如抗氧劑、抑菌劑及其他認為需要進行監控的成分含量的測定；

4、原料或制劑中雜質（包括工藝雜質和降解雜質）的定量或*；

5、溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。

二、分析方法驗證所包含的內容：

1、專屬性Specificity；

2、準確度Accuracy ，也被稱為回收率Recovery；

3、精密度Precision（包括重復性Repeatability、中間精密度Intermediateprecision和重現性Reproducibility）；

4、檢測限（Detection Limit，LOD）；

5、定量限（Quantitation Limit，LOQ）；

6、線性（Linearity）；

7、范圍（Range）；

8、耐用性（Robustness）。

三、各項內容的具體解析

1、專屬性Specificity：

專屬性系指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。能反映該方法在有共存物時對供試物準確而專屬的測定能力，是指該方法用于復雜樣品分析時是否受到相互干擾程度的度量。如方法專屬性不強，應采用多種不同原理的方法予以補充。鑒別反應、雜質檢査和含量測定方法，均應考察其專屬性。

A. 鑒別反應

應能區分可能共存的物質或結構相似的化合物。不含被測成分的供試品，以及結構相似或組分中的有關化合物，應均呈陰性反應。

B.含量測定和雜質測定

采用的色譜法和其他分離方法，應附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應標明各成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應符合要求。

?在雜質對照品可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質或輔料的試樣比較測定結果。對于雜質檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質，考察各成分包括雜質之間能否得到分離。

?在雜質或降解產物不能獲得的情況下，可將含有雜質或降解產物的試樣進行測定，與另一個經驗證了的方法或藥典方法比較結果。也可用強光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能存在的降解產物和降解途徑對含量測定和雜質測定的影響。含量測定方法應比對兩種方法的結果，雜質檢査應比對檢出的雜質個數，必要時可采用光二極管陣列檢測和質譜檢測，進行峰純度檢查。

綜上，專屬性包括兩方面：

一是對各組分進行定位，以稀釋劑和空白輔料不干擾檢測評價專屬性是否良好；

二是經強制降解后的樣品主峰與相鄰雜質峰間分離度符合要求（≥1.5）。

2、準確度Accuracy：

準確度是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，用回收率%表示。準確度應在規定的線性范圍內試驗，準確度也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來。如上圖所示，左邊為準確度高的結果，右側為準確度低的結果。測定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗法”和“加樣回收試驗法”。

準確度數據要求：規定的范圍內，取同一濃度（相當于100%濃度水平）的供試品，用至少 6 份樣品的測定結果進行評價；或設計高中低3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進行測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價。兩種方法的選定應考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。對于有關物質檢查的準確度，還需對定量限水平的準確度進行評價。

A. 化學藥含量測定方法的準確度
原料藥可用已知純度的對照品或供試品進行測定，或用所測定結果與已知準確度的另一個方法測定的結果進行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測物對照品進行測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中加入已知量的被測物進行測定，或用所建立方法的測定結果與已知準確度的另一個方法測定結果進行比較。

B. 化學藥雜質定量測定的準確度
可向原料藥或制劑中加入已知量雜質對照品進行測定。如不能得到雜質對照品，可用所建立的方法與另一成熟方法（如藥典標準方法或經過驗證的方法）的測定結果進行比較。

C. 中藥化學成分測定方法的準確度
可用已知純度的對照品進行加樣回收率測定，即向已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。在加樣回收試驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測分含有量之和必須在標準曲線線性范圍之內；加入的對照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。

3、精密度Precision（包括重復性Repeatability、中間精密度Intermediateprecision和重現性Reproducibility）

（如上圖所示，左邊的圖精密度良好，但是準確度不符合要求；右邊的圖平均值的準確度符合要求，但是精密度較差）。

精密度系指在規定的測定條件下，同一份均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性；

重復性數據要求：在規定范圍內，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測定濃度，相當于100%濃度水平）的供試品，用至少測定6份的測定結果進行評價；或設計3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進行測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價。采用至少9份測定結果進行評價時， 濃度的設定應考慮樣品的濃度范圍。

在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度，稱為中間精密度，中間精密度是考察隨機變動因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對精密度的影響，一個*的分析方法驗證應進行中間精密度的測試。

在不同實驗室由不同分析人員測定結果之間的精密度，稱為重現性。在常規的分析方法驗證中，未必都會進行重現性的考察。但是在分析方法從研發實驗室轉到QC實驗室的過程中，通常會進行重現性的考察。

含量測定和雜質的定量測定應考察方法的精密度。

精密度數據要求：應報告偏差、標準偏差、相對標準偏差或置信區間。樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考ChP2015版中9101中可接受范圍表。

偏差、標準偏差、相對標準偏差計算公式如下所示：

4、檢測限（DetectionLimit，LOD）

檢測限是指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的低濃度或含量。它是限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高于或低于該規定濃度即可。檢測限的測定包括以下幾種方法：

A.直觀法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的低濃度或量。

B.信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的被測物質低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

C.標準差法：

①測定背景10次以上，求出標準差σb；

②將σb乘以三倍；

③在工作曲線上求出3σb相對應的濃度Xb；即為檢出限；

④將求得的對應濃度值加上空白值（空白值為0則不加）即得檢出限。

5、定量限（QuantitationLimit，LOQ）

定量限是指樣品中被測物能被定量測定的低量，結果應具有一定準確度和精密度要求。定量限試驗方法包括：

A.非儀器分析目視法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的符合準確度和精密度要求的低濃度或量。

B.信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地定量的被測物質的低濃度或量。一般以信噪比為10:1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限。

C.基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法：按照 LOQ = 10δ/S 公式計算。

式中 LOQ：定量限；

δ：響應值的偏差；

S：標準曲線的斜率。
δ 可以通過下列方法測得：

①測定空白值的標準偏差；

②采用標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。

定量限數據要求：定量限需同時滿足精密度要求和準確度要求。

6、線性（Linearity）

線性系指在設計的范圍內，測定響應值或其經數學轉化的形式與試樣中被測物濃度直接呈比例關系的程度。

應在設計的范圍內測定線性關系。可用同一對照品貯備液經精密稀釋，或分別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進行測定，至少制備5種不同濃度的供試樣品。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖，觀察是否呈線性，再用小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經數學轉換，再進行線性回歸計算?；蛘呖刹捎妹枋鰸舛?響應關系的非線性模型。

線性數據要求：至少需要五個濃度考察線形，需提供相關系數、 y截距（是檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數，應列出回歸方程數和線性圖。

7、范圍（Range）

范圍系指分析方法能達到精密度、準確度和線性要求時的高低限濃度或量的區間。范圍應根據分析方法的具體應用及其線性、準確度、精密度結果和要求確定。

?原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的80%～120%；

?制劑含量均勻度檢査，范圍一般為測定濃度的 70%～130%, 特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當放寬；

?溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的±30%，如規定了限度范圍，則應為下限的－20%至上限的＋20%；

?雜質測定，范圍應根據初步實際測定數據，擬訂為雜質報告水平至規定限度的 120%計算，則線性范圍應為雜質規定限度的－20%至含量限度（或上限）的＋20%。

在中藥分析中，范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗證范圍應大于被限定含量的區間。

范圍是綜合了線性、精密度，準確度后的結果，不一定與線性范圍一致。

8、耐用性（Robustness）

耐用性又稱粗放度，系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規檢驗提供依據。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明，并注明可以接受變動的范圍，可以先采用均勻設計確定主要影響因素，再通過單因素分析等確定變動范圍。

典型的變動因素有：被測溶液的穩定性、樣品的提取次數、時間等。

液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成和pH值、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。

氣相色譜法變動因素有：不同品牌或批號的色譜柱、不同類型的擔體、載氣流速、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。

經試驗， 測定條件小的變動應能滿足系統適用性試驗要求， 以確保方法的可靠性。

液相色譜的典型變動：

• 流動相PH（±0.5)；
• 流動相組成(有機相±5%）；
• 色譜柱（同一廠家的三個批號，或兩個不同廠家（固定相和填充物相同，尺寸）
• 溫度（20-25℃)和流速(±10%）
• 檢測波長(±5nm)

氣相色譜的典型變動：
• 色譜柱（同一廠家的三個批號，或兩個不同廠家（同固定相和填充物，尺寸）
• 溫度
• 流速

分析方法的驗證比較簡單，只要按照指導原則對每一個驗證模塊去仔細地完成，肯定不會出錯。哪怕不是很了解驗證的目的，在大框架上也不會出錯。當然，對于方法驗證中每個模塊的深入了解，能幫助我們在日常工作中更好地設計方法學的驗證，能讓方法學驗證更加科學，合理，并且能更加地完成。